通过感光元器件实现对事物的控制，“光控”在现实生活中已慢慢普及，例如手机人脸识别解锁、汽车雾灯自动开启……这次被光操控的是基因编辑。我国科学家的这一研究成果近日发表在《科学·进展》杂志上。
“LED发出的730nm（纳米）的远红光可激活系统进行基因编辑工作。”论文通讯作者、华东师范大学生命科学学院、医学合成生物学研究中心研究员叶海峰对科技日报记者表示，只有在光照到的地方，基因的“编辑”“剪切”才会发生，从而真正做到指哪剪哪。
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创建关键元件 为基因编辑装上自动开关
CRISPR-Cas9基因编辑技术近年来应用广泛，被形象地称为“基因剪刀”，使得人类掌握了简便可行的基因“操控术”。
然而，要更便捷地操控基因编辑，需要一个“便捷按钮”，让人们按一下就能启动，再按一下就能关闭，推动其走进“自动化时代”。尤其当基因编辑要走进临床应用，必须要具有灵活、高精度的操控方法，才能使其更具安全性。
“实现光控”需要在基因编辑前装一个“光感装置”用于“引爆”，这个装置长什么样子？有哪些零件？
在红细菌中有一种蛋白BphS，它在接收到远红光的信号后会被激活，释放一个信号。而在放线菌里的蛋白BldD，接收到这个信号后能与DNA序列结合。
“我看到这个信息的时候，觉得非常兴奋。前一种蛋白让光和生物体‘接上头’，后一种蛋白又‘链接’上了DNA。”叶海峰说，这种“跨界打通”意味着有很多工作可做，因为只要信号能传导到DNA，就能推进生物学的操控。
叶海峰团队以放线菌中的BldD蛋白为基础，将其亲和DNA序列与哺乳动物的转录激活子融合，创制了一个杂交型的转录激活子，这一开关成为按下基因编辑“启动键”的关键元件。
这一元件的前方设置了光敏蛋白，接收光信号；后方连接上“基因剪刀”Cas9核酸酶。这个巧妙的设计使得整个系统只有感光后，才能够启动基因编辑。光控基因编辑的“图纸”就此设计完成。
验证上百种序列 拼出远红光操控的编辑系统
理论“图纸”和关键元器件都已准备就绪，叶海峰团队开始用合成生物学的方法对这些关键元器件进行组装。
令人意想不到的是，在细胞水平的验证中，基因编辑并没有因为光的有无而产生明显的变化，远红光照射没能刺激Cas9核酸酶的高量表达，熄灭光源也没有阻止基因编辑工作。
问题出在了哪里？按照“图纸”设计，整个流程应该是无懈可击的。
叶海峰百思不得其解。“这一研究工作我们持续推进了5年，有的关键性问题如果不能解决将会耽误整个研究的进展。”叶海峰说，合成生物学要在活体内运转，会有很多无法排查的意外。它不像编程，跑一遍会有纠错，或者至少会提示哪个部分出现“BUG”。
这次的“BUG”出现在哪里？启动基因的工作被相继验证。2017年、2018年，叶海峰课题组在《科学·转化医学》《美国科学院院刊》相继发表论文，证明了远红光调控转基因表达控制系统的可行性以及基因编辑CRISPR-dCas9酶的转录激活都是可行的。
“我们试验了各种方案，但整个系统的运行却都失败了。”叶海峰说，这个结果意味着需要对策略进行根本性的调整。
直到有一天，叶海峰在《自然·生物技术》上看到一篇张锋（基因编辑技术发明人之一）的文章，上面说基因编辑的Cas9核酸酶可以一拆为二，拆开来之后的两半再合起来也是有功能的。
“受到这样的启发，我们就想可不可以把它拆成两半，一半是连续的强表达（自始至终一直表达），另一半用光驱动调控来表达。”叶海峰说，就像“钥匙”的两半拼在一起才能开锁一样。
“拼”这个动作又要怎么自动实现呢？叶海峰想到了热纤维梭菌中的一对能够自发相互结合的蛋白Coh2和DocS。让它们加入进来，分别与Cas9的两部分融合，Coh2和DocS就会像“磁石”一样，将Cas9的两部分拼装成完整、有功能的Cas9核酸酶。
“究竟是哪一半用光来调控诱导表达，都是有说法的。”叶海峰回忆，课题组对多种情况进行了试验，至少进行了上百种不同序列的验证，以寻找最佳光控基因编辑效果。
“我们还对整个系统进行了优化，例如质粒的浓度配比，核输入信号和核输出信号的选择及组合等，并在细胞水平进行了测试。”叶海峰说，经过严谨的优化，实验结果最终令人满意，并将其命名为“FAST系统”。
研究结果显示，FAST系统在LED发射的低强度远红光照射下可以诱导细胞内的基因编辑，而在黑暗情况下保持“静默”的效果也很好。
进一步研究表明，FAST系统在多种细胞中均显示出可调控的基因编辑效果，并具有很好的光照强度和时间依赖性，以及高度的时空特异性，为研究FAST系统在动物体内的可调控基因编辑能力奠定了基础。
“我们至今也不太清楚为什么直接调控表达完整Cas9核酸酶的系统不成功。”叶海峰说，不按程序走，这就是生命科学的神奇之处，而合成生物学正是在破解这些意外中积累起来，最终解决更大的科学命题。
光照时间太长 活体高效递送还需“打怪升级”
生命体是复杂的，在细胞水平运转良好的系统在活体中能不能工作，仍面临着重重挑战。为此，在进行了细胞验证后，研究团队还进行了转基因报告模型小鼠和肿瘤模型小鼠的验证工作。
“让整个系统在活体中工作，会遇到新的问题，比如递送的问题。”叶海峰解释，FAST系统由好几个质粒组成，它们进入细胞比较简单，但能不能突破重重阻碍进入到组织细胞里面呢？比如高效递送到肝脏和肿瘤组织里面，就需要借助于递送系统，而且递送的效率直接决定整个系统的工作效率。
“研究推进时，递送技术是又一个难题，我们最初直接通过静脉注射，效果却不是那么好。”叶海峰说，“细胞中工作的质粒在进入活体的时候受到了阻碍，因为整个系统承载的元件太多，所有元件同时递送的效率不能保证，且质粒会被机体认为是外来物而被清除掉。”
想进入活体，整个系统还需要再调整。“这就好比原来坐的卡车太大了、目标明显，需要换乘一个‘特洛伊木马’潜进去。”叶海峰说。
研究团队后来在合作团队的帮助下，使用另一种更小的、能够整合进细胞里的质粒进行递送工作。实验结果中，转基因小鼠在肝脏部位显示出了基因编辑的报告情况，表明小鼠肝脏细胞中DNA可通过光控编辑。
实体瘤是比组织器官更致密的组织，进入其中则需要进一步升级递送系统。
“为了把FAST系统高效递送到肿瘤组织细胞里面，我们与浙江大学专门制作DNA分子递送的团队合作，用纳米技术合成的材料实现了向肿瘤组织的高效递送。”叶海峰说。
在肿瘤小鼠模型中的验证结果显示，将FAST系统递送至小鼠体内的肿瘤后，通过远红光LED的照射，FAST系统能切割肿瘤致癌基因，从而显着抑制肿瘤的生长。
再好的技术只有走进应用才能实现价值。“之所以希望实现光控，初心就是希望推进广泛的应用。”叶海峰说，实验也证明了远红光可以透过小鼠的皮肤进入到小鼠的肝脏内部，甚至进入到实体瘤内部。这意味着FAST系统有疾病治疗的应用潜力。
叶海峰表示，团队仍在进一步优化光控基因表达系统，例如现在的光控系统需要光照2小时才能工作，而未来希望得到改进后，照射几秒就能产生效果。
来源：科技日报
